Основным методом исследования биологических объектов, используемым в гистологии, является микроскопирование, т.е. изучение гистологических препаратов под микроскопом. Микроскопия может быть самостоятельным методом изучения, но в последнее время она обычно сочетается с другими методами (гистохимии, гисторадиографии и другие). Следует помнить, что для микроскопии используются разные конструкции микроскопов, позволяющие изучить разные параметры изучаемых объектов.
Различают следующие виды микроскопии:
световая микроскопия (разрешающая способность, ограниченная длиной волн белого света,- 0,2 мкм) - наиболее распространенный вид микроскопии;
ультрафиолетовая микроскопия (разрешающая способность, за счет использования более коротких ультрафиолетовых волн, 0,1 мкм);
люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия для определения химических веществ в рассматриваемых структурах;
фазово-контрастная микроскопия для изучения структур в неокрашенных гистологических препаратах;
поляризационная микроскопия для изучения, главным образом, волокнистых структур;
микроскопия в темном поле для изучения живых объектов;
микроскопия в падающем свете для изучения толстых объектов;
электронная микроскопия (разрешающая способность, благодаря ничтожной длине волн летящих электронов, до 0,1-0,7 нм), в двух ее разновидностях: просвечивающая (трансмиссионная) электронная микроскопия и сканирующая, или растровая микроскопии, которая дает трехмерное отображение поверхности ультраструктур.
Гистохимические и цитохимические - методы, суть которых заключается в использовании строгоспецифических химических реакций со светлым конечным продуктом в клетках и тканях для определения химического состава различных веществ (нуклеиновых кислот, белков, ферментов, жиров, углеводов и т.д.). Можно применить на уровне светового или электронного микроскопа.
Количественная цитофотометрия – метод, дающий возможность количественно оценить выявленные цитогистохимическим методом нуклеиновые кислоты, белки, ферменты и т.д. с помощью фотометрии объекта в изучаемых структурах.
Метод гистоавторадиографии основан на введении в организм веществ, содержащих радиоактивные изотопы химических элементов. Эти вещества включаются в обменные процессы в клетках. Локализация, дальнейшие перемещения этих веществ в органах определяются на гистопрепаратах по излучению, которое улавливается фотоэмульсией, нанесенной на препарат.
Рентгеноструктурный анализ позволяет определить количество химических элементов в клетках, изучить молекулярную структуру биологических микрообъектов, выявить состав химических веществ в структурах и интенсивность обмена по включению радиоактивных изотопов в изучаемые структуры. Метод используется чаще всего в экспериментах на животных.
Метод дифференциального центрифугирования позволяет изучать отдельные органеллы или даже фрагменты, выделенные из клетки. Для этого кусочек исследуемого органа растирают, заливают физиологическим раствором, а затем разгоняют в центрифуге или ультрацентрифуге, создающей перегрузку в десятки и cотни тысяч g при различных оборотах (от 2-х до 350 тыс.), и получают интересующие фракции (например, митохондрий или лизосом), которые затем изучают различными методами.
Метод интерфер енционной микроскопии используют для определения сухого остатка в клетках, а также толщины живых или фиксированных объектов.
Иммуноморфологические методы позволяют с помощью предварительно проведенных иммунных реакций на основании взаимодействия антиген-антител определять субпопуляции лимфоцитов, степень чужеродности клеток, проводить гистологическое типирование тканей и органов (определять гистосовместимость) для трансплантации органов.
Микрохирургия - проведение очень тонких операций микроманипулятором под микроскопом (пересадка ядер, введение в клетки различных веществ, измерение биопотенциалов и т.д.).
Метод культуры клеток (in vitro, in vivo) - выращивание клеток и тканей в питательных средах или в диффузионных камерах, имплантированных в различные ткани организма, и последующее изучение живых клеток под микроскопом.
В последние десятилетия обычно используется комплекс разнообразных методик, позволяющий составить не только качественное представление об изучаемых структурах, но и получить точные количественные характеристики. Особенно широко в настоящее время используются различные морфометрические методики, в том числе автоматизированные системы обработки полученной информации с использованием компьютеров.
Единицы измерения, используемые в гистологии
Для измерения структур в световой микроскопии используются в основном микрометры: 1 мкм составляет 0,001 мм; в электронной микроскопии в качестве единицы измерения используются нанометры: 1 нм составляет 0,001 мкм (отсюда можно судить о размерах объектов в нанотехнологиях).
Определение понятия «ткань» и классификация тканей
В результате эволюционного развития у высших Metazoa произошла дифференциация организма на ткани. Ткани - это исторически (филогенетически) сложившиеся системы клеток и неклеточных структур, обладающих общностью строения, в ряде случаев общностью происхождения, и специализированные на выполнении определенных функций. Ткань может состоять из однородных клеток (например, почти все клетки, за исключением стволовых, в эпителиальные ткани), но может включать в себя и несколько видов клеток (например, клетки крови имеют общее происхождение, но в зрелом состоянии различны по форме, строению и выполняемым функциям). Любая ткань содержит межклеточное вещество, которое имеет характерный состав, плотность и другие параметры. Соотношение клеток и межклеточного вещества в разных тканях неодинаково: в тканях внутренней среды (костях, крови, жировой ткани) межклеточного вещества много, а в эпителиальных и мышечных - мало.
В любой системе все ее элементы упорядочены в пространстве и функционируют согласованно друг с другом; система в целом обладает при этом свойствами, не присущими ни одному из ее элементов, взятому в отдельности. Соответственно и в каждой ткани ее строение и функции не сводимы к простой сумме свойств отдельных входящих в нее клеток и межклеточного вещества. Ведущими элементами тканевой системы являются клетки. Кроме клеток, различают клеточные производные и, как уже говорилось, межклеточное вещество.
К производным клеток относят симпласты (например, мышечные волокна, наружная часть трофобласта), синцитий (развивающиеся мужские половые клетки, пульпа эмалевого органа), а также постклеточные структуры (эритроциты, тромбоциты, роговые чешуйки эпидермиса и т.д.).
Межклеточное вещество подразделяют на основное вещество и на волокна. Оно может быть представлено золем, гелем или быть минерализованным. Среди волокон различают обычно три вида: коллагеновые, ретикулярные, эластические.
Имеется несколько классификаций тканей. Еще в 1835-37 гг. Лейдиг и Келликер предложили разделить ткани на 4 группы: эпителиальные, соединительные, мышечные, нервные. Н.Г. Хлопин создал теорию дивергентного развития тканей в фило- и онтогенезе, т.е. объяснил, как и какими путями происходило развитие и становление тканей. Соответственно этой теории Хлопин выдвинул генетическую классификацию тканей. Согласно Хлопину, из 8 зачатков - энтодермы, целомической выстилки, энтомезенхимы, миотомов, хорды, кожной эктодермы, нейроэктодермы, прехордальной пластинки - в ходе дивергентной дифференцировки путем расхождения признаков образуются все виды тканей; поэтому в основу этой классификации тканей положены источники развития. А.А. Заварзин обратил внимание на сходное строение аналогичных тканей, у представителей разных групп животных, т.е. во всех случаях строение объясняется выполняемой функцией, и создал теорию параллельных рядов тканевой эволюции. Эта теория дополняет теорию дивергентной эволюции тканей Хлопина и объясняет, почему развитие тканей шло таким, а не иным путем, раскрывает причинные аспекты эволюции тканей. В соответствии с теорией параллельных рядов академик Заварзин обосновал морфофункциональную классификацию тканей: система пограничных тканей, система тканей внутренней среды, система мышечных тканей, ткани нервной системы.
В наши дни наиболее распространенной является так называемая морфофункциональная классификация, учитывающая строение и функциональные отправления тканей, по которой выделяют четыре группы тканей:
эпителиальные ткани;
ткани внутренней среды;
мышечные ткани;
нервная ткань.
К тканям внутренней среды относятся соединительные ткани, кровь и лимфа.
Эпителиальные ткани характеризуются объединением клеток в пласты или тяжи. Через эти ткани совершается обмен веществ между организмом и внешней средой. Эпителиальные ткани выполняют функции защиты, всасывания и экскреции. Источниками формирования эпителиальных тканей являются все три зародышевых листка — эктодерма, мезодерма и энтодерма.
Ткани внутренней среды (соединительные ткани, кровь и лимфа) развиваются из так называемой эмбриональной соединительной ткани - мезенхимы. Ткани внутренней среды характеризуются наличием большого количества межклеточного вещества и содержат различные клетки. Они специализируются на выполнении трофической, пластической, опорной и защитной функций.
Мышечные ткани специализируются на выполнении функции движения. Они развиваются в основном из мезодермы (поперечно-исчерченная ткань) и мезенхимы (гладкая мышечная ткань).
Нервная ткань развивается из эктодермы и специализируется на выполнении рецепторной, регуляторной и координирующей функции - восприятии, проведении и передаче информации.